11张图像看清活细胞三维动态：一种高速、无标记成像新方法

Shun Zhou, Qian Shen, Habib Ullah, Kaiyu Du, Linpeng Lu, Hongjun Wu, Yao Fan, Jiasong Sun, Dayong Jin, Qian Chen, and Chao Zuo, “Spatiotemporal-multiplexed Fourier ptychographic diffraction tomography for high-speed, label-free 3D imaging of live cells” Adv. Photon. 8, 026003 (2026).

研究背景

自列文虎克首次观察到微生物世界以来，光学显微技术不断向更高分辨率与更高成像对比度迈进。在生物成像中，细胞和组织通常呈现透明、低对比度特性，因此，实现高对比度成像始终是核心挑战。超分辨荧光显微技术虽然能够提供纳米级空间分辨率和优异的分子特异性，但荧光标记并不适用于所有细胞器或生物组。此外，外源染料可能扰动细胞生理状态，光漂白与光毒性也限制了其在长时程活细胞成像中的应用。

相比之下，相位成像通过利用细胞内部折射率差异，实现无标记的高对比度成像。作为代表性方法之一，光学衍射层析成像（optical diffraction tomography, ODT）能够对透明细胞的三维折射率分布进行重建。然而，传统ODT通常依赖对振动敏感的激光干涉测量，易产生散斑噪声，在一定程度上限制空间分辨率。近年来，基于LED照明的非干涉ODT在系统简化和成像质量方面取得进展，但仍需通过顺序变角采集散射场以覆盖足够的傅里叶空间，成像速度依然受限。此外，已有的照明复用和部分相干策略多集中于二维相位成像；扩展至三维ODT时，通常还需机械轴向扫描获取离焦强度堆栈，进一步降低时间分辨率。虽然稀疏采样可以提升成像速度，但往往以牺牲重建质量为代价。这些限制使得现有ODT难以满足毫秒尺度亚细胞动态观测的需求。

针对上述问题，南京理工大学陈钱教授、左超教授与悉尼科技大学金大勇教授等合作提出了一种面向活细胞动态三维成像的非干涉ODT新方法——时空复用傅立叶叠层衍射层析（spatiotemporal-multiplexed Fourier ptychographic diffraction tomography, STM-FPDT）。该方法将传统傅里叶叠层衍射层析中的空间相干成像机制拓展为相干/部分相干混合成像，通过与物镜数值孔径匹配的环形混合照明，在保持相位对比的同时实现频谱的并行采集。结合滑动时间窗口与非线性全局优化，研究团队构建了时空协同层析重建框架，将生物结构在时空（x–y–z–t）域中的连续性作为先验约束。在此基础上，STM-FPDT仅需11幅强度图像即可完成三维折射率重建，实现约5 Hz的成像速率，并在347 nm横向分辨率和1.54 μm轴向分辨率下有效抑制亚细胞动态带来的运动伪影。相关成果以“Spatiotemporal-multiplexed Fourier ptychographic diffraction tomography for high-speed, label-free 3D imaging of live cells”为题，发表在Advanced Photonics 2026年第2期。

研究内容

1. STM-FPDT原理与时空协同重建框架

作者从光场传播与散射建模出发，系统构建了STM-FPDT的成像理论框架。与传统FPDT需要在不同入射角下逐次采集散射场不同，STM-FPDT引入相干/部分相干混合照明，实现频谱信息的并行获取。

实验上，研究团队在商用显微镜平台上集成了包含45个独立可寻址LED单元的可编程环形光源，并设计循环照明时序，每一帧仅需采集11幅原始强度图像，在相位对比、频谱覆盖与系统稳定性之间取得良好平衡。

在重建算法方面，作者将三维散射势（折射率分布）重建建模为带有时空总变分正则项的优化问题，并采用基于差分映射的强度约束迭代算法进行求解。通过引入空间分段平滑性与时间连续性先验，该方法在极少测量数据条件下仍能实现稳定、高质量的三维重建。

以未染色原发性肝癌细胞为例，STM-FPDT可连续获取折射率体数据，并以5 Hz速率完成逐帧三维重建。在相同理论分辨率条件下，其采集时间较传统FPDT缩短约4.5倍（图1c）。同时，结合滑动时间窗口与全局优化策略（图1d），显著提升了重建稳定性与鲁棒性，使系统能够在高时空分辨率下实现亚细胞动态过程的无标记观测。

图1 STM-FPDT系统用于活细胞无标记三维成像的原理图

2. 运动模糊对活细胞成像质量的影响

在活细胞三维动态成像中，细胞运动引起的模糊会显著降低成像质量。作者以未染色原发性肝癌细胞为对象，将STM-FPDT与FPDT（45个照明角度）、aIDT（annular intensity diffraction tomography，45个照明角度）及FPDT（11个照明角度）三种方法进行了对比（图2）。

对于运动较慢的细胞核结构，STM-FPDT与采用45个照明角度的FPDT成像质量相当；而采用11个照明角度的FPDT因频谱信息不足出现明显折射率低估，aIDT则存在一定模糊。对于运动更快的脂滴结构，STM-FPDT表现出明显优势，能够清晰分辨目标，而其他方法均受到不同程度的运动模糊影响。实验结果表明，该系统可实现347 nm横向分辨率和1.54 μm轴向分辨率，并在约15 μm成像深度范围内保持可靠的轴向重建能力。

图2 活细胞动态三维成像中的动态模糊

3. PLC细胞膜胞吞/胞吐过程与肌动蛋白丝收缩的动态可视化

借助STM-FPDT的高时空分辨率，作者实现了对胞吞、胞吐及肌动蛋白丝动态行为的三维可视化（图3）。在原发性肝癌细胞中，细胞膜附近低折射率区域对应囊泡的形成与演化过程，可清晰观察到膜的起伏、褶皱及囊泡的融合与消失。随着这一动态过程的持续推进，囊泡在细胞中的占比逐渐降低，进一步揭示了细胞膜重塑与物质运输的时空演变过程。同时，研究还记录了细胞边缘肌动蛋白丝的动态变化过程，甚至捕捉到其断裂瞬间。背景区域重复测量结果表明，折射率测量精度达到1.18×10⁻³，肌动蛋白丝的平均半高全宽约为610 nm，验证了成像结果的可靠性。

图3 PLC细胞膜起泡及肌动蛋白丝动态三维成像展示

4. 揭示线粒体与其他细胞器相互作用的动力学

线粒体是真核生物氧化代谢的中枢，通过氧化为细胞提供必需的能量。它们的形态和数量变化与细胞代谢活动密切相关。在线粒体实验中，作者完整记录了线粒体分裂过程（图4，图5）：由拉伸、变细到最终分裂为两个子体，并通过时间曲线标定关键事件发生时刻，测得线粒体直径约为746 nm。此外，STM-FPDT还揭示了线粒体与脂滴、囊泡之间的动态相互作用，例如脂滴沿线粒体迁移、囊泡旋转并最终被线粒体包裹等。这表明该方法不仅能够解析结构信息，还具备研究细胞器动态关系的能力。

图4 PLC细胞线粒体动力学观测结果

图5 PLC细胞线粒体动力学动态可视化

5. 脂滴轨迹追踪与细胞间相互作用分析

该技术进一步实现了对细胞内脂滴的高精度三维追踪，清晰呈现其空间轨迹与动态变化过程（图6），并为基于时序三维信息的特征提取与细胞器分割提供了有力的技术支撑。在细胞间相互作用研究中（图7），作者记录了细胞膜融合及线粒体跨细胞迁移过程：随着膜融合推进，细胞边界逐渐消失，丝状线粒体发生跨细胞转移；约21分钟后迁移完成，细胞边界重新建立，完整呈现了细胞间物质交换与结构重构的时序演变。细胞迁移作为免疫反应、组织修复及肿瘤转移等关键生命过程的基础，其动态机制的精细解析具有重要意义。借助STM-FPDT实现的高时空分辨率三维成像，有望为深入理解相关生理与病理过程提供关键实验依据，并为疾病发生发展机制研究及潜在治疗策略的制定提供重要参考。

图6 STM-FPDT辅助PLC细胞内脂滴的三维动态追踪结果

图7 PLC细胞间相互作用的可视化

总结与展望

研究提出的STM-FPDT技术，实现了高速、无标记的活细胞三维成像，在采集效率、成像速度及抗运动模糊能力方面均表现出显著优势，同时保持较高空间分辨率。实验表明，该方法能够清晰观测细胞膜动态、囊泡演化、肌动蛋白行为、线粒体分裂及细胞间相互作用等关键生命过程。由于该技术仅需对传统明场显微镜进行有限改造，具有良好的可推广性，为活细胞动态过程的定量研究提供了一条切实可行的技术路径。未来，STM-FPDT有望拓展至多模态成像，例如结合荧光成像获取分子特异性信息，或引入偏振与各向异性对比机制，以进一步提升成像维度与信息容量。随着相关研究的深入发展，该技术有望为复杂细胞生理与病理机制的解析提供更加全面而精准的光学手段。